首頁(yè)  奧林巴斯顯微鏡 熒光顯微鏡 熒光附件  案例應(yīng)用

熒光顯微鏡技術(shù)的基本原理是借助熒光劑讓細(xì)胞成分呈現(xiàn)高度具體的可視化效果，比如在目的蛋白后面連一個(gè)通用的熒光蛋白—GFP。在組織樣本中，目的基因無(wú)法進(jìn)行克隆，則需要用免疫熒光染色等其他技術(shù)手段來(lái)觀察目的蛋白。為此，就需要利用抗體，這些抗體連接各種不同的熒光染料，直接或間接地與相應(yīng)的靶結(jié)構(gòu)相結(jié)合。此外，借助熒光染料，熒光顯微鏡技術(shù)不只局限于蛋白質(zhì)，它還可以對(duì)核酸、聚糖等其他結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色，即便鈣離子等非生物物質(zhì)也可以檢測(cè)出來(lái)。本文就對(duì)幾種常用的熒光劑進(jìn)行了具體的介紹。

免疫熒光 (IF)

在熒光顯微鏡技術(shù)中，可以通過兩種方式觀察到你的目的蛋白：利用內(nèi)源熒光信號(hào)，即通過克隆手段，用遺傳學(xué)方法將熒光蛋白與目的蛋白相連；或利用熒光標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合目的蛋白。有些生物學(xué)問題采用第二種方法會(huì)更有用或更有必要。比如，組織學(xué)樣品無(wú)法使用熒光蛋白，因?yàn)橥ǔ��?lái)說(shuō)，標(biāo)本都是從無(wú)法保存熒光蛋白的生物體中獲取。此外，當(dāng)有一個(gè)有功能的抗體可用時(shí)，免疫熒光法會(huì)比熒光蛋白技術(shù)快很多，因?yàn)楹笳弑仨毾瓤寺∧康幕�因再將DNA轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)募?xì)胞中。熒光蛋白的另一項(xiàng)劣勢(shì)在于其本身屬于蛋白質(zhì)。因此，細(xì)胞內(nèi)的這些熒光蛋白具有特定的蛋白質(zhì)特性，其會(huì)導(dǎo)致附著的目的蛋白質(zhì)發(fā)生功能紊亂或出現(xiàn)誤釋的情況。然而，熒光蛋白技術(shù)仍然是觀察活細(xì)胞的首選方法。

免疫熒光法利用了抗體可以和相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的這個(gè)特性，對(duì)此它還有兩種不同的表現(xiàn)形式。簡(jiǎn)單的方式是使用可與目的蛋白相結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。這種方法被稱為“直接免疫熒光法”。

在很多情況下，我們可以利用兩種不同特性的抗體。第一種抗體可以結(jié)合目的蛋白，但其本身并未進(jìn)行熒光標(biāo)記（一抗）。第二種抗體本身就攜帶熒光染料（二抗），并且可以特異性結(jié)合一抗。這種方法被稱為“間接免疫熒光法”。這種方法存在諸多優(yōu)勢(shì)。一方面，它會(huì)產(chǎn)生放大效應(yīng)，因?yàn)椴恢灰粋�(gè)二抗可以與一抗相結(jié)合。另一方面，沒有必要始終用熒光染料標(biāo)記目的蛋白的每個(gè)抗體，但可以使用市售熒光標(biāo)記的二抗。免疫熒光中廣泛使用的熒光染料包括 FITC、TRITC 或一些Alexa Fluor®染料，下文均有提及。

FITC 和 TRITC

異硫氰酸熒光素(FITC) 是一種有機(jī)熒光染料，目前，這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中。在 495/517 nm 處，該染料會(huì)產(chǎn)生激發(fā)/發(fā)射峰值，并可借助異硫氰酸鹽反應(yīng)基團(tuán)與不同抗體結(jié)合，該基團(tuán)可以和蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、咪唑、酪氨酰、羰基等基團(tuán)相結(jié)合。而它的基本成分—— 熒光素，其摩爾質(zhì)量為 332 g/mol，常被用作熒光示蹤劑。FITC(389 g/mol) 是用于熒光顯微鏡技術(shù)的首批染料，且其被當(dāng)成 Alexa Fluor®488 等后續(xù)熒光染料的發(fā)端。該染料的熒光活性取決于它的大共軛芳香電子系統(tǒng)，而該系統(tǒng)受藍(lán)色光譜中的光所激發(fā)。

經(jīng)常與 FITC 同時(shí)使用的另一種染料是與其相似的TRITC [四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸]。與 FITC 相反，TRITC 并非熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明也具有一個(gè)大的共軛芳香電子系統(tǒng)，正是該系統(tǒng)引發(fā)了它們的熒光行為。還有一點(diǎn)與FITC 相反，TRITC (479 g/mol) 由大波長(zhǎng)為 550nm的綠色光譜中的光所激發(fā)，它的大發(fā)射波長(zhǎng)為 573 nm。與蛋白質(zhì)（例如，抗體）結(jié)合也基于異硫氰酸鹽反應(yīng)基團(tuán)。

雖然 FITC 和 TRITC 仍在使用，但由于它們屬于發(fā)光相對(duì)較弱的熒光染料且它們的優(yōu)勢(shì)僅僅是經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，因此，在新的顯微鏡技術(shù)中并不推薦。

圖 1：果蠅胚胎發(fā)育，綠色：FITC；紅色：TRITC

青色素

這類熒光染料相對(duì)較少，從青色素衍生而來(lái)，也是其名稱的由來(lái)：Cy2、Cy3、Cy5 和Cy7。上述所有青色素均可以通過其反應(yīng)基團(tuán)與核酸或蛋白相連。例如，采用了蛋白標(biāo)記的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。有趣的是，對(duì)于熒光，Cy5 對(duì)其周邊電子環(huán)境非常敏感，該特征可用于酶測(cè)定。附著蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變會(huì)導(dǎo)致熒光發(fā)射產(chǎn)生陽(yáng)性或陰性變化。此外，Cy3 和 Cy5 還可用于 FRET 試驗(yàn)。青色素染料是一種相對(duì)較老的熒光染料，但卻是其他熒光染料在亮度、耐光性、量子產(chǎn)率等方面得以改善的基礎(chǔ)。