首頁(yè) 奧林巴斯熒光顯微鏡 熒光顯微鏡 熒光附件  案例應(yīng)用

Alexa Fluor®染料

Alexa Fluor®染料是帶負(fù)電荷且親水的熒光染料系列，該系列染料囊括范圍較廣，且經(jīng)常用于熒光顯微鏡技術(shù)之中。這些染料的名稱是由其發(fā)明者Richard Paul Haugland 以他兒子 Alex Haugland 的名字命名的。該產(chǎn)品標(biāo)識(shí)是 Molecular Probes（美國(guó)生命科學(xué)技術(shù)公司 Life Technologies旗下子公司，注：2014年2月Life Technologies被Thermo Fisher收購(gòu)）的商標(biāo)。此外，這些產(chǎn)品標(biāo)識(shí)中也涵蓋了相應(yīng)的激光激發(fā)波長(zhǎng)。例如，應(yīng)用范圍很廣且大激發(fā)波長(zhǎng)為 493 nm的Alexa Fluor®488，可由標(biāo)準(zhǔn)的488 nm激光激發(fā)。Alexa Fluor®488的大發(fā)射波長(zhǎng)為 519 nm，正是因?yàn)榫邆渖鲜鎏匦�，使�?Alexa Fluor®488與 FITC 的屬性相似。盡管 Alexa Fluor®488是一種熒光素衍生物，但與 FITC 相反，它擁有更佳的穩(wěn)定性和熒光亮度，且 pH 敏感度也更低。所有 Alexa Fluor® 染料（比如，Alexa Fluor®546、Alexa Fluor®633）都是不同基礎(chǔ)熒光物質(zhì)的磺化形式，例如，熒光素、香豆素、青色素或羅丹明，它們的摩爾質(zhì)量在410 至 1400 g/mol 范圍之內(nèi)。

圖 2：小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎、肢間體節(jié)，E10.5 小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎的 5 個(gè)肢間體節(jié)：EpaxialMyf5 eGFP；GFP-Alexa 488 免疫組化染色；用 Desmin-Cy3 對(duì)胚胎肌肉纖維進(jìn)行染色，用 Hoechst Size 自上而下揭示細(xì)胞核：3.5 mm (a)，800 µm (b)。圖片來(lái)源：Aurélie Jory, CellulesSouches et Développement, Institut Pasteur, Paris,France and Imaging centre of IGBMC, IGBMC。

圖 3：小鼠成纖維細(xì)胞，綠色：F-Actin，F(xiàn)ITC；紅色：Tubulin，Cy5；藍(lán)色：細(xì)胞核，DAPI。圖片來(lái)源：德國(guó)·海德?tīng)柋?middot;馬克斯-普朗克研究所·Günter Giese博士

DNA 染色

在熒光顯微鏡技術(shù)中，不只研究蛋白結(jié)構(gòu)，核酸同樣具有重要的研究意義。有時(shí)候，必須通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞核來(lái)確定細(xì)胞的精確位置及其數(shù)量。常用的一種DNA 染色劑當(dāng)屬 DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚) ，其可與DNA 雙螺旋的 A-T 富集區(qū)域相結(jié)合。如果 DAPI 附著到 DNA 上，其熒光強(qiáng)度將比游離狀態(tài)要高。該染色劑受大波長(zhǎng)為358 nm的紫外光激發(fā)，其發(fā)射光譜非常寬，在461 nm 處達(dá)到峰值。此外，還可對(duì)弱熒光進(jìn)行 RNA 結(jié)合檢測(cè)。在這種情況下，發(fā)射波長(zhǎng)將轉(zhuǎn)移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能夠穿透整個(gè)細(xì)胞膜。因此，它可以用于固定和活細(xì)胞之中。

第二種被廣泛使用的DNA 染色劑就是 Hoechst 染料系列，這些染料原先都是由 Hoechst AG 這家化學(xué)公司生產(chǎn)的。Hoechst 33258、Hoechst 33342以及Hoechst 34580 均為雙苯酰亞胺，可嵌入 A-T 富集區(qū)域，因此，該系列染料很少用到。與 DAPI 相似，這三種染色劑都可受大發(fā)射波長(zhǎng)為455 nm的紫外光激發(fā)，而未被結(jié)合的染色劑，其大發(fā)射波長(zhǎng)在 510–540 nm 之間。Hoechst 染色劑還具有細(xì)胞滲透性，因此可用于活細(xì)胞或已固定的細(xì)胞中。該染色劑與DAPI 的不同之處在于，它們的毒性較低。

碘化丙啶（Propidium-Iodide，PI）是一種不能透過(guò)細(xì)胞膜的 DNA 染色劑。由于具備上述特性，該染色劑無(wú)法進(jìn)入完整的細(xì)胞中，因此，該染色劑常用于區(qū)分細(xì)胞群中的活細(xì)胞和死細(xì)胞。此外，碘化丙啶還是一種嵌入劑，但對(duì)于不同的堿基并不存在結(jié)合的差異性。該染色劑與核酸結(jié)合后，大激發(fā)波長(zhǎng)為538 nm，大發(fā)射波長(zhǎng)為 617 nm。未結(jié)合 PI 的大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)和光強(qiáng)會(huì)更低一些。PI 還可結(jié)合 RNA，同時(shí)無(wú)需改變自身的熒光特性。有時(shí)候?yàn)榱藚^(qū)分DNA 和 RNA，有必要使用適當(dāng)?shù)暮怂崦浮?/span>

不需要前期處理，吖啶橙就可以鑒別DNA 與 RNA 。吖啶橙與 DNA 結(jié)合后，大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為 502 nm/525 nm，而與 RNA 結(jié)合后，大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm/650 nm。此外，它還能夠進(jìn)入溶酶體等酸性區(qū)室。在這里，陽(yáng)離子染料被質(zhì)子化。在這種酸性環(huán)境下，吖啶橙由藍(lán)色光譜中的光激發(fā)，但發(fā)射波長(zhǎng)在橙色區(qū)域達(dá)到大。由于凋亡細(xì)胞具有大量被吞噬的酸性區(qū)室，因此，吖啶橙常用作此類細(xì)胞的標(biāo)記物。

區(qū)室和細(xì)胞器特異性染料

在熒光顯微鏡技術(shù)中，往往要對(duì)溶酶體、核內(nèi)體等細(xì)胞區(qū)室以及線粒體等細(xì)胞器進(jìn)行染色。為此，該部分介紹了一系列可供選擇使用的特異性染料。

觀察線粒體常用的方法就是利用 MitoTracker®，它是一種可透過(guò)細(xì)胞的染料，包含輕度巰基化的氯甲基活性部分。正因如此，它可與半胱氨酸殘基的游離硫醇基反應(yīng)，從而與基質(zhì)蛋白實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合。MitoTracker® 有不同的顏色和修飾類型（參見(jiàn)表 1），此外，它還是 Molecular Probes 的商標(biāo)。與羅丹明 123 (Rh123) 或 tetramethylrosamine等常規(guī)線粒體特異性染色劑不同，在用固定劑破壞膜電位后，MitoTracker®不會(huì)被洗掉。

依據(jù)線粒體染色劑，還有些染料可以標(biāo)記溶酶體等酸性區(qū)室，這類染料被稱為L(zhǎng)ysoTracker。它們由連接一個(gè)熒光基團(tuán)的弱堿基團(tuán)組成，具有膜穿透性。有可能的情況是，這些堿基因質(zhì)子化作用的影響而對(duì)酸性區(qū)室具有親和性。LysoTracker具有多種不同的顏色可供選擇（參見(jiàn)表 1）。

與溶酶體相似的區(qū)室是釀酒酵母等真菌中的液泡，這種膜密閉空間也是一種酸性環(huán)境。如果要在熒光顯微鏡下觀察上述區(qū)室，則要使用FM 4-64®或FM 5-95®等苯乙烯基染料。

對(duì)于蛋白質(zhì)分泌實(shí)驗(yàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 具有重要的研究意義。對(duì)上述區(qū)室進(jìn)行染色的一種典型染料為DiOC6(3)。該染料雖然偏好 ER，但仍會(huì)結(jié)合線粒體等其他細(xì)胞器膜。對(duì)ER 進(jìn)行特異性染色的另一種方法是，使用 ER-Tracker Green 和 Red 等 ER-Tracker，而 ER-Tracker Green 和 Red 是基于 BODIPY 的兩種染料，其與格列本脲（一種磺酰基脲酶）連接，并可與僅存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的ATP敏感性鉀通道結(jié)合。BODIPY（硼-二吡咯亞甲基，boron-dipyrromethene）是一種幾乎不溶于水的、對(duì)pH 相對(duì)不敏感的染料基團(tuán)，該染料對(duì)蛋白質(zhì)標(biāo)記沒(méi)太大用處，但卻是脂質(zhì)和膜標(biāo)記的良好工具。

對(duì)于與ER相鄰的高爾基體，可以用 NBD C6-ceramide 和BODIPYFL C5-ceramide 等熒光神經(jīng)酰胺類似物對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。 上述神經(jīng)酰胺為鞘脂類，其在高爾基體中高度富集。

借助基于脂質(zhì)的染料，可以對(duì)脂筏等特異膜區(qū)域進(jìn)行染色。使用 NBD-6Cholestrol或NBP-12 Cholesterol 可以觀察膽固醇富集區(qū)域（Avanti Polar Lipids）。

除了使用特異性非蛋白熒光染料對(duì)細(xì)胞區(qū)室進(jìn)行標(biāo)記之外，還可以借助對(duì)細(xì)胞中不同位置有偏好的蛋白質(zhì)對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行染色。這些蛋白質(zhì)可以和熒光染料相連，并可通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。運(yùn)用這種方法的一個(gè)實(shí)例是：麥胚凝集素(WGA) 可以與細(xì)胞質(zhì)膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特異性結(jié)合，將WGA 與熒光染料偶聯(lián)，這樣我們就可以觀察到細(xì)胞質(zhì)膜了。

圖 4：Pukinje細(xì)胞，小鼠小腦皮質(zhì)三重標(biāo)記的縱側(cè)截面圖。紅色：anti-calbindin-D28k/Cy3；綠色：anti-GFAP/Cy5；藍(lán)色：Hoechst 33258

圖 5：牛肺部?jī)?nèi)皮細(xì)胞。紅色：用 MitoTracker®Red CMXRos 標(biāo)記的線粒體；綠色：用綠色熒光 BODIPY®FLphallacidin 標(biāo)記的纖維狀肌動(dòng)蛋白；藍(lán)色：用 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核。使用三維盲反褶積可以改善該圖像的質(zhì)量。